WSSV là gì và xét nghiệm WSSV bằng PCR như thế nào?

WSSV được phát hiện ở đâu và tại sao chọn mô lại quan trọng?

WSSV là virus DNA nhưng biểu hiện bệnh phụ thuộc tải lượng và vật chủ

WSSV có bộ gen DNA sợi đôi lớn và có thể hiện diện ở mức thấp trước khi xuất hiện dấu hiệu rõ. Đốm trắng không phải dấu hiệu tuyệt đối đặc hiệu; ngược lại, tôm nhiễm có thể chưa có đốm trắng. PCR phát hiện trình tự virus, còn kết luận ổ dịch cần kết hợp biểu hiện, mô bệnh học, dịch tễ và hướng dẫn chuyên ngành áp dụng.

Lựa chọn mô và bảo quản

Mang, biểu mô dưới cutin, chân bơi và các mô đích thường được sử dụng; tránh chỉ dựa vào một loại mẫu nếu mục tiêu là điều tra ca nghi ngờ. Mẫu cho PCR cần được giữ theo quy trình bảo toàn DNA, hạn chế phân hủy và nhiễm chéo. Không dùng chung dụng cụ cắt giữa cá thể nếu chưa khử nhiễm thích hợp.

Độ đặc hiệu phải xét cả trình tự của vật chủ và tác nhân liên quan

Primer/probe cần được kiểm tra trên tập trình tự WSSV đa dạng và các trình tự không đích có khả năng hiện diện trong tôm. Một plasmid dương tính chỉ chứng minh đoạn đích có thể khuếch đại; không chứng minh phép thử hoạt động trên mẫu mô thật. Thẩm định phải có mẫu nền âm, mẫu dương tự nhiên hoặc vật liệu mô phỏng thích hợp, đánh giá ức chế và LOD toàn quy trình.

Một assay tốt trên plasmid chưa chắc tốt trên tôm

WSSV là ví dụ điển hình cho việc phép thử thiết kế và mẫu sinh học phải đi cùng nhau. Khi hai kit cho kết quả không đồng thuận, cần kiểm đích trình tự, lượng đầu vào, tách chiết và ngưỡng cắt thay vì chỉ so thương hiệu.

Plasmid là vật liệu hữu ích để kiểm tra phản ứng, nhưng nó bỏ qua ly giải mô, chất ức chế và cấu trúc DNA đích trong mẫu thật. Vì vậy, phát triển assay WSSV cần thêm mẫu dương toàn quy trình hoặc mẫu thực địa đã được xác nhận bằng phương pháp độc lập. Nếu chỉ dựa vào plasmid, độ nhạy nhìn thấy trên máy thường lạc quan hơn hiệu năng thực tế.

Từ tiếp nhận mẫu đến xác nhận một kết quả WSSV

Việc đầu tiên là xác định mục đích sử dụng: giám sát, sàng lọc hay chẩn đoán. Sau đó cần thu mẫu: ghi rõ mô, mẫu gộp và bảo quản. Bước kế tiếp là tách chiết: kiểm internal control và mẫu kiểm soát tách chiết.

Khi các thông tin ban đầu đã rõ, chuyển sang PCR/qPCR: đối chứng dương/âm. Trước khi chấp nhận kết quả, cần kết quả không đồng thuận: thử lại/xác nhận bằng phương pháp độc lập theo kế hoạch.

Mẫu dương mạnh với kit thương mại nhưng âm với assay tự phát triển

Tình huống: mẫu PT WSSV: Mẫu dương thực tế cho Ct 11 với kit tham chiếu nhưng âm với phép thử đang phát triển; nội chuẩn phép thử vẫn khuếch đại. Plasmid chứa đoạn đích của phép thử lại dương. Mẫu hình này làm giảm khả năng ức chế toàn phản ứng và đặt nghi vấn vào độ bao phủ trình tự/thiết kế primer-probe hoặc vùng đích không phù hợp. Bước tiếp theo có giá trị là rà căn chỉnh trình tự và xác nhận vùng đích trên mẫu thật, không tiếp tục chỉ đổi hỗn hợp phản ứng chính.

Các nguyên nhân nên kiểm tra trước khi tăng nồng độ primer

Kết luận phải nằm trong giới hạn của mẫu và assay

• Không dùng Ct của kit A làm ngưỡng cắt cho kit B.
• Duy trì phép thử nên rà trình tự định kỳ khi có biến thể mới.
• Thiết kế gộp/lấy mẫu ảnh hưởng phát hiện ở mức quần thể.
• Tham khảo WOAH và yêu cầu quốc gia khi phục vụ quản lý dịch bệnh.

Đọc tiếp trong Technical Hub

• Tổng quan PCR trong chẩn đoán bệnh tôm
• Vì sao mẫu có tải lượng mầm bệnh cao nhưng PCR vẫn âm tính?
• Kiểm soát nhiễm trong phòng PCR bệnh thủy sản

Công cụ CGB có thể hỗ trợ

• qPCR Analysis

Giải pháp liên quan

• Quy trình PCR/qPCR WSSV

Tài liệu tham khảo

• World Organisation for Animal Health (WOAH). Chapter 2.2.8. Infection with white spot syndrome virus.

• TCVN 8710-3:2019 BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 3: BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM.

• Leal CA, Carvalho AF, Leite RC, Figueiredo HC. Development of duplex real-time PCR for the detection of WSSV and PstDV1 in cultivated shrimp. BMC Vet Res. 2014 Jul 5;10:150. doi: 10.1186/1746-6148-10-150. PMID: 24996437; PMCID: PMC4110376.