Nồng độ thấp và tổng lượng thu hồi thấp không phải một chuyện
Lượng thu hồi thấp có thể là thất thoát thật hoặc phép đo sai
Ở nồng độ thấp, NanoDrop dễ bị ảnh hưởng bởi mẫu trắng và hấp thụ nền; Qubit đo chọn lọc hơn nhưng vẫn phụ thuộc thuốc thử và dải chuẩn. Trước khi kết luận tách chiết kém, cần xác nhận phương pháp định lượng phù hợp và mẫu nằm trong dải đo.
Cân bằng giữa khối lượng đầu vào và sức chứa hệ tách
Quá ít mẫu làm giảm khả năng thu hồi; quá nhiều làm quá tải màng/hạt, tăng độ nhớt và đồng chiết tạp chất. Mẫu giàu tế bào, mô xơ, chất béo hoặc polysaccharide cần ly giải và tiền xử lý khác nhau. Tăng đầu vào không tuyến tính với lượng thu hồi.
Phân tích theo từng công đoạn
Đánh giá ly giải bằng quan sát/marker; kiểm tra flow-through để xem acid nucleic không gắn; kiểm tra rửa/rửa giải; thử rửa giải hai lần hoặc gia nhiệt phù hợp; dùng thêm chuẩn ngoại sinh để ước lượng thu hồi. Nếu bước sau PCR đạt và nội chuẩn ổn, một số đo lượng thu hồi thấp đơn lẻ có thể không có ý nghĩa thực hành.
Mỗi bước tách chiết có một kiểu làm mất nucleic acid
Lượng thu hồi thấp ảnh hưởng qPCR, giải trình tự, tạo dòng và các bước sau các phép thử khác. Một quy trình theo dõi cân bằng khối lượng từ lượng đầu vào đến dịch rửa giải sẽ giúp tìm bước mất mẫu.
Elution bằng thể tích nhỏ thường làm nồng độ tăng nhưng tổng lượng thu hồi có thể giảm. Ngược lại, thể tích lớn làm nồng độ thấp hơn dù tổng lượng nucleic acid cao hơn. Vì vậy, cần phân biệt concentration với yield. Phản ứng sau đó cần nồng độ hay cần tổng lượng sẽ quyết định cách tối ưu.
Điều tra từ lượng đầu vào đến dịch elution
Việc đầu tiên là đánh giá lượng đầu vào: loại mẫu, lượng và tình trạng. Sau đó cần kiểm tra ly giải: có hoàn toàn không. Bước kế tiếp là chuẩn bị buffer: ethanol và hạn dùng.
Khi các thông tin ban đầu đã rõ, chuyển sang sức chứa: cột/bead nạp mẫu. Trước khi chấp nhận kết quả, cần rửa giải: thể tích/thời gian/nhiệt độ. Phần cuối cùng là kiểm tra chất lượng chức năng: PCR hoặc phép thử bước sau.
Elution ít thể tích cho nồng độ cao nhưng yield giảm
Tình huống: quá tải cột: Tăng khối lượng mô từ 20 lên 80 mg không làm lượng thu hồi tăng bốn lần; cột tắc, A260/A230 giảm và nội chuẩn qPCR chậm. Khi chia 80 mg thành bốn lần tách riêng rồi gộp dịch rửa giải, tổng lượng DNA tăng và ức chế giảm. Sức chứa và hiệu quả ly giải, không chỉ khối lượng mẫu, quyết định lượng thu hồi sử dụng được.
Những cách tăng yield thường làm purity xấu đi
| Hiện tượng | Nguyên nhân cần xem xét | Hành động ưu tiên |
|---|---|---|
| Cột tắc | Cặn/độ nhớt | Làm trong sơ bộ hoặc giảm lượng đầu vào. |
| RNA phân hủy | RNase/thời gian/nhiệt độ | RNase kiểm soát, xử lý nhanh. |
| Nồng độ thấp | Rửa giải quá lớn | Giảm thể tích hợp lý. |
| Tổng độ thu hồi thấp | Liên kết/rửa giải kém | Rà hệ hóa học/re-rửa giải. |
Đánh giá bằng ứng dụng sau tách chiết và mass balance
- Đo lượng thu hồi bằng phương pháp phù hợp; phép đo độ hấp thụ có thể ước tính cao khi có chất nhiễu.
- Bước sau PCR là kiểm tra chức năng hữu ích.
- Không so lượng thu hồi giữa nền mẫu khác nhau mà bỏ lượng đầu vào.
- Theo dõi lô/người thao tác nếu có xu hướng giảm lượng thu hồi.
Đọc tiếp trong Technical Hub
- Cột silica tách chiết DNA/RNA hoạt động như thế nào?
- Vì sao PCR bị ức chế sau tách chiết DNA/RNA?
- Cột silica và hạt từ: nên lựa chọn công nghệ nào?
Giải pháp liên quan
- Kit tách chiết DNA/RNA
Tài liệu tham khảo
- Boom R và cộng sự. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology. 1990;28(3):495–503.
- Jiang T, Feng Z, Yuan L. Overcoming inconsistent DNA extraction recovery across tissue types in qPCR assays supporting biodistribution studies. Bioanalysis. 2026 Mar;18(4):355-366. doi: 10.1080/17576180.2026.2664205. Epub 2026 Apr 27. PMID: 42037403; PMCID: PMC13215310.
Bài viết được đội ngũ kỹ thuật Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Cao Gia biên soạn từ kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm thực tế và tham khảo các tìa liệu chuyên ngành.
Do đặc thù của từng dòng thiết bị, điều kiện vận hành tại mỗi phòng thí nghiệm và yêu cầu của từng hệ thống quản lý chất lượng có thể khác nhau, nội dung trong bài viết chỉ nhằm chia sẻ thêm góc nhìn cho kỹ thuật viên, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm và những người làm việc trong các lĩnh vực liên quan.
Nội dung bài viết không thay thế quy trình thao tác chuẩn (SOP), hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất hoặc các tài liệu kỹ thuật có liên quan. Mọi quyết định áp dụng chỉ nên được thực hiện sau khi người sử dụng đã hiểu rõ bản chất kỹ thuật, mục đích ứng dụng, các rủi ro có thể phát sinh và xác nhận tính phù hợp với điều kiện thực tế.
Chúng tôi trân trọng mọi ý kiến phản biện, góp ý chuyên môn và phản hồi từ Quý độc giả, Quý khách hàng. Mọi thông tin xin gửi về địa chỉ: marketing@caogiabiotech.com.
Đội ngũ Kỹ thuật Công nghệ Sinh học Cao Gia
Tận tâm – Uy tín – Đồng hành cùng phát triển
