Khi nói đến xét nghiệm kháng thể Tembusu, câu hỏi không chỉ là:
Có kháng thể hay không?
Điểm quan trọng hơn là:
kháng thể đó nhận diện kháng nguyên nào, và xét nghiệm đang đo loại đáp ứng miễn dịch nào?
Trong DTMUV, protein E là một trong những mục tiêu được nghiên cứu nhiều nhất.
1. Vì sao protein E quan trọng?
Hình. Căn chỉnh trình tự amino acid và tổ chức domain của protein E ở DTMUV và các flavivirus liên quan. Hình cho thấy các vùng bảo tồn, vị trí biến đổi và sự phân bố các domain cấu trúc của protein E, là cơ sở để nghiên cứu tính kháng nguyên và epitope của protein này, Nguồn: PLOS ONE, doi:10.1371/journal.pone.0071319.g003.
Envelope protein E nằm trên bề mặt virus và là một protein cấu trúc quan trọng của flavivirus.
Trong nghiên cứu về DTMUV, protein E được xem là một mục tiêu lớn của đáp ứng kháng thể, đặc biệt liên quan đến neutralizing antibody. [4]
Chính vì vậy E protein đã được sử dụng trong nhiều hướng:
- antigen cho ELISA;
- mục tiêu tạo monoclonal antibody;
- epitope mapping;
- nghiên cứu neutralization;
- phát triển vaccine;
- xây dựng antigen-capture assay.
2. Binding antibody (kháng thể liên kết) và neutralizing antibody (kháng thể trung hòa) không giống nhau
Một kháng thể (Antibody) có thể:
- gắn được vào antigen;
- nhưng chưa chắc trung hòa được virus.
Đây là điểm rất quan trọng khi đọc kết quả ELISA.
Một phản ứng có thể phát hiện kháng thể nhận diện protein E dựa vào một số epitope nhất định, nhưng kết quả dương tính không mặc nhiên đồng nghĩa rằng toàn bộ kháng thể trong mẫu đều có chức năng trung hòa (neutralization) kháng nguyên.
Neutralizing antibody (kháng thể trung hòa) là nhóm kháng thể có khả năng ngăn cản/ chống lại quá trình ngăn xâm nhiễm của virus.
3. Một số epitope trên protein E đã được xác định
Zhao và cộng sự khảo sát 13 peptide từ E protein và xác định bốn vùng tiềm năng:
- P21: aa 301-329
- P23: aa 369-387
- P27: aa 464-471
- P28: aa 482-496
Trong nghiên cứu này, kháng thể sinh ra chống P21, P27 và P28 có khả năng trung hòa được Tembusu virus; P21 và P27 còn cho thấy khả năng bảo vệ vịt trong mô hình challenge của nghiên cứu. [4]
Điều này cho thấy: Không phải toàn bộ các kháng thể kháng protein E đều có giá trị bảo vệ giống nhau. Vị trí epitope có thể ảnh hưởng mạnh tới chức năng của kháng thể.
4. EDIII là một vùng đáng chú ý
Hình. Vị trí epitope EVEPPFG trên domain III của protein E DTMUV. Epitope được xác định tại vùng aa 374–380 và được biểu diễn trên mô hình cấu trúc dimer của protein E. Hình minh họa cách một monoclonal antibody có thể nhận diện một epitope cụ thể thay vì toàn bộ protein E – Nguồn: Li C. et al., Scientific Reports, 2016. DOI: 10.1038/srep36288
Domain III của E protein, thường gọi là EDIII, cũng được nghiên cứu như một vùng mục tiêu quan trọng của neutralizing antibody ở flavivirus.
Trong nghiên cứu của Qu và cộng sự, monoclonal antibody 12F11 được tạo từ EDIII tái tổ hợp và thể hiện hoạt tính trung hòa được với TMUV. 12F11 nhận diện một epitope nằm trong vùng amino acid 8-77 của EDIII và Kháng thể 12F11 có thể trung hòa virus bằng cách cản trở quá trình virus bám vào tế bào, đồng thời còn ảnh hưởng đến một số bước xảy ra sau khi virus đã bám. [5]
Kết quả này minh họa một điểm quan trọng: Không chỉ “có kháng thể hay không”, mà kháng thể nhận diện vùng nào của protein E cũng có ý nghĩa.
5. Monoclonal antibody có thể được dùng để xây xét nghiệm như thế nào?
Có hai hướng rất điển hình.
Antigen-capture ELISA
Bai và cộng sự tạo sáu mAb-E: 2A5, 1F3, 1G2, 1B11, 3B6, 4F9
Sau đó 1F3 và 3B6 được sử dụng để phát triển antigen-capture ELISA nhằm phát hiện DTMUV antigen. [2] Trong trường hợp này: kháng thể là nguyên liệu để, còn thứ cần phát hiện là antigen
Blocking ELISA
Một hướng khác là dùng monoclonal antibody làm đối thủ cạnh tranh với antibody trong serum.
Li và cộng sự phát triển neutralizing monoclonal antibody 1F5 nhận diện E protein và sử dụng nó để xây blocking ELISA nhằm phát hiện neutralization-related antibodies chống DTMUV. [6]
Đây là một cách tiếp cận khác với indirect ELISA thông thường.
Blocking ELISA không chỉ đơn giản đo “kháng thể gắn protein”, mà hướng tới nhóm kháng thể có liên quan gần hơn tới epitope chức năng của mAb sử dụng trong phản ứng.
6. E-protein ELISA trong huyết thanh học
Yin và cộng sự sử dụng recombinant E protein làm coating antigen để phát triển indirect ELISA phát hiện antibody kháng TMUV trong huyết thanh vịt.
So với serum neutralization test, assay trong nghiên cứu đạt:
- sensitivity: 97,8%
- specificity: 93,2%
trong tập mẫu được đánh giá. [3]
Điểm cần lưu ý là các con số này thuộc assay cụ thể trong nghiên cứu, không nên dùng như thông số mặc định cho mọi Tembusu ELISA thương mại.
7. Ngoài protein E, thì còn có một số protein khác cũng đã được nghiên cứu.
Ngoài E protein, NS1 cũng đã được nghiên cứu. Zhou và cộng sự phát triển một indirect ELISA dựa trên NS1 antigen cho phản ứng phát hiện DTMUV và ứng dụng trong khảo sát huyết thanh học. Bài báo nhấn mạnh nhu cầu cải thiện chẩn đoán huyết thanh học và hướng tới vấn đề phân biệt nhiễm với vaccine, nhưng giá trị DIVA cụ thể vẫn phụ thuộc thiết kế vaccine và assay. [7]
Điểm thực tế ở đây là: Khi đánh giá một ELISA kháng thể, nên hỏi:
- coating antigen là gì?
- whole virus?
- recombinant E?
- EDIII?
- NS1?
- peptide/epitope cụ thể?
Bởi mỗi antigen có thể dẫn tới ý nghĩa sinh học khác nhau của kết quả.
8. Cách đọc một kết quả antibody-positive
Một kết quả kháng thể cho kết quả dương tính (antibody-positive) có thể phù hợp với nhiều tình huống:
- từng nhiễm Tembusu trước đó;
- đang ở giai đoạn sau của đáp ứng miễn dịch;
- đã được vaccine;
- còn kháng thể tồn lưu;
- hoặc đang ở giai đoạn nhiễm mà kháng thể đã hình thành.
Do đó: xét nghiệm kháng thể dương tính không đồng nghĩa với virus hiện đang có mặt trong mẫu.
Nếu mục tiêu là xác định virus trực tiếp, cần cân nhắc RT-PCR hoặc antigen detection.
Nếu mục tiêu là:
- giám sát dịch tể, kháng thể;
- đánh giá đáp ứng miễn dịch;
- nghiên cứu tỷ lệ phơi nhiễm;
- theo dõi vaccine;
thì xét nghiệm kháng thể có giá trị hơn.
Kết luận
Trong đánh giá một trường hợp nghi ngờ Tembusu tại trại hoặc trên đàn, chỉ một chỉ tiêu đơn lẻ thường chưa phản ánh đầy đủ hoặc có thể bỏ sót quá trình xâm nhiễm của virus/ diễn biến của chương trình vaccine.
RT-qPCR, E-ELISA kháng nguyên và Ab-ELISA cung cấp ba lớp thông tin khác nhau nhưng bổ sung cho nhau: RT-qPCR cho biết có RNA mục tiêu của virus trong mẫu hay không; E-ELISA cung cấp thông tin về sự hiện diện của protein/kháng nguyên virus; trong khi Ab-ELISA giúp đánh giá đáp ứng kháng thể của vật chủ.
Vì vậy, với các phòng thí nghiệm thường xuyên thực hiện chẩn đoán, giám sát hoặc điều tra dịch tễ Tembusu, việc có khả năng triển khai cả ba hướng xét nghiệm sẽ giúp xây dựng bức tranh đầy đủ hơn về tình trạng đàn, đặc biệt khi cần phân biệt giữa bằng chứng hiện diện trực tiếp của virus và đáp ứng miễn dịch đã hình thành.
Trong thực hành, lựa chọn xét nghiệm vẫn cần dựa trên mục tiêu kiểm tra, loại mẫu, thời điểm lấy mẫu, lịch sử vaccine/phơi nhiễm và diễn biến lâm sàng của đàn; khi cần đánh giá toàn diện, có thể phối hợp RT-qPCR, Antigen E-ELISA và Antibody ELISA thay vì diễn giải kết quả từ một xét nghiệm đơn độc.
- Đọc thêm bài viết: Tembusu virus ở vịt: nên xét nghiệm RNA, kháng nguyên hay kháng thể?
- Giải pháp kiểm tra Tembusu virus : Xem giải pháp xét nghiệm Tembusu của Cao Gia Biotech
Tài liệu tham khảo
[2] Bai X, Shaozhou W, Zhang Q, et al. Characterization of monoclonal antibodies against duck Tembusu virus E protein: an antigen-capture ELISA for the detection of Tembusu virus infection. Archives of Virology. 2015;160(3):757-764. doi:10.1007/s00705-014-2312-z.
[3] Yin X, Lv R, Chen X, Liu M, Hua R, Zhang Y. Detection of specific antibodies against Tembusu virus in ducks by use of an E protein-based enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Clinical Microbiology. 2013;51(7):2400-2402. doi:10.1128/JCM.00361-13.
[4] Zhao D, Han K, Huang X, et al. Screening and identification of B-cell epitopes within envelope protein of Tembusu virus. Virology Journal. 2018;15:142. doi:10.1186/s12985-018-1052-1.
[5] Qu S, Wang X, Yang L, et al. Identification of a neutralizing monoclonal antibody that recognizes a unique epitope on domain III of the envelope protein of Tembusu virus. Viruses. 2020;12(6):647. doi:10.3390/v12060647.
[6] Li X, Li G, Teng Q, et al. Development of a blocking ELISA for detection of serum neutralizing antibodies against newly emerged duck Tembusu virus. PLoS ONE. 2012;7(12):e53026. doi:10.1371/journal.pone.0053026.
[7] Zhou Q, Bi Z, Yin D, Gu X, Xu Z, Huang R, Xing X, Qi K, Wang G. Development and application of an indirect ELISA for the serological detection of duck Tembusu virus infection based on the NS1 protein antigen. Archives of Virology. 2020;165(3):709-714. doi:10.1007/s00705-019-04495-4.
LƯU Ý : Bài viết được tổng hợp từ các tài liệu khoa học
Nội dung bài viết không thay thế quy trình thao tác chuẩn (SOP), hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất hoặc các tài liệu kỹ thuật có liên quan. Mọi quyết định áp dụng chỉ nên được thực hiện sau khi người sử dụng đã hiểu rõ bản chất kỹ thuật, mục đích ứng dụng, các rủi ro có thể phát sinh và xác nhận tính phù hợp với điều kiện thực tế.
Chúng tôi trân trọng mọi ý kiến phản biện, góp ý chuyên môn và phản hồi từ Quý độc giả, Quý khách hàng. Mọi thông tin xin gửi về địa chỉ: [email protected].
CAO GIA BIOTECH
Tận tâm – Uy tín – Đồng hành cùng phát triển
