Những sai lầm thường gặp khi xây dựng đường chuẩn trong real-time PCR và cách khắc phục
Khái quát:
Trong các xét nghiệm real-time PCR (qPCR), đặc biệt là các xét nghiệm định lượng, việc xây dựng đường chuẩn (standard curve) là bước bắt buộc nhằm đánh giá hiệu suất khuếch đại và định lượng chính xác nồng độ DNA/RNA mục tiêu. Tuy nhiên, trong thực hành tại phòng lab, nhiều kỹ thuật viên vẫn gặp lỗi dẫn đến sai lệch kết quả, hoặc không đạt tiêu chuẩn đánh giá.
Bài viết này sẽ giúp bạn nhận diện 5 sai lầm phổ biến nhất khi xây dựng đường chuẩn trong real-time PCR và hướng dẫn cách khắc phục đơn giản – hiệu quả.
1. Tại sao phải xây dựng đường chuẩn trong qPCR?
-
Đường chuẩn là tập hợp các điểm chuẩn (thường 5–7 nồng độ pha loãng liên tiếp) được dùng để:
-
Đánh giá hiệu suất khuếch đại (amplification efficiency)
-
Tính toán độ tuyến tính (R²)
-
Nội suy nồng độ DNA/RNA trong mẫu không biết
-
-
Trong kiểm nghiệm thực phẩm, thú y, hoặc xét nghiệm môi trường, các đường chuẩn này giúp định lượng virus, vi khuẩn, gene kháng kháng sinh, độc tố v.v.
2. Các sai lầm phổ biến khi xây dựng đường chuẩn
a. Pha loãng không đúng kỹ thuật
-
Dùng pipet không chính xác khi pha loãng tuần tự → nồng độ chuẩn không còn chính xác
-
Không trộn đều sau mỗi bước pha → nồng độ thực tế không đồng nhất
-
Dùng tips không thay → nguy cơ nhiễm chéo
Hậu quả: Đường cong méo, hiệu suất PCR vượt mức 110% hoặc dưới 90%
b. Không kiểm tra độ lặp lại (triplicate)
-
Chỉ chạy mỗi nồng độ chuẩn 1 lần → không đánh giá được sai số kỹ thuật
-
Ct giữa các bản sao chênh lệch >0.5 → dữ liệu không đáng tin
Hậu quả: Đường chuẩn không ổn định, không dùng để nội suy được
c. Chọn nồng độ chuẩn không phù hợp
-
Khoảng nồng độ quá rộng hoặc quá hẹp → không phản ánh được phổ hoạt động hiệu quả của PCR
-
Pha loãng 10x liên tiếp nhưng bắt đầu từ nồng độ sai (ví dụ 109 thay vì 106) → các điểm nằm ngoài ngưỡng phát hiện
Hậu quả: Không định lượng được mẫu có nồng độ cao/thấp
d. Không tính toán slope & hiệu suất PCR
-
Chỉ nhìn R² mà bỏ qua slope
-
Không tính hiệu suất PCR theo công thức:
E=(10−1/slope − 1)×100
→ Slope lý tưởng: –3.3 (ứng với hiệu suất ~100%)
Hậu quả: Hệ thống vẫn báo R² > 0.99 nhưng thực chất khuếch đại không đạt chuẩn
e. Không dùng chứng âm và chứng không template (NTC)
-
Không chạy NTC → không phát hiện được ô nhiễm primer, probe, hoặc DNA nền
-
Không có mẫu âm → khó phân biệt dương tính thật/giả
Hậu quả: Mẫu âm dương hóa, gây nhận định sai kết quả lâm sàng
3. Cách khắc phục và thiết lập đường chuẩn hiệu quả
| Yếu tố | Giải pháp |
|---|---|
| Pipet & thao tác | Dùng pipet hiệu chuẩn, tips lọc, trộn đều sau mỗi pha loãng |
| Thiết kế nồng độ | 5–7 điểm chuẩn, pha loãng 10x, bắt đầu từ 10⁷ hoặc 10⁶ bản sao |
| Chạy triplicate | Mỗi nồng độ chạy ít nhất 3 bản sao để tính độ lệch |
| Đánh giá hiệu suất | Sử dụng phần mềm (Bio-Rad, Thermo, Qiagen…) tính R², slope |
| Chạy chứng âm & NTC | Luôn thêm ít nhất 1 giếng NTC và mẫu âm theo mẻ |
4. Ví dụ thực tế trong kiểm nghiệm
-
ASFV (Dịch tả heo châu Phi): yêu cầu đường chuẩn đạt hiệu suất từ 90–110%, R² > 0.99 để định lượng chính xác tải lượng virus
-
E. coli O157:H7 trong thực phẩm: cần xây dựng đường chuẩn để xác định ngưỡng phát hiện giới hạn (LOD)
-
Gene mcr-1 (kháng colistin): định lượng trong thức ăn chăn nuôi yêu cầu kiểm soát cực kỳ chặt chẽ đường chuẩn
Một số lưu ý khi chọn mẫu chuẩn và thể tích pha loãng
✅ Chọn mẫu chuẩn phù hợp để xây dựng đường chuẩn
Việc lựa chọn vật liệu chuẩn có vai trò cực kỳ quan trọng để đảm bảo tính chính xác và độ lặp lại trong định lượng:
| Loại mẫu chuẩn | Ưu điểm | Khuyến nghị sử dụng |
|---|---|---|
| DNA tổng hợp (gBlocks, plasmid) | Ổn định, dễ bảo quản, định lượng rõ ràng | Thích hợp cho định lượng virus, vi khuẩn đặc hiệu |
| RNA chuẩn (in vitro transcripted) | Phản ánh chính xác quy trình RT-PCR | Dùng trong xét nghiệm virus RNA như PRRSV, PEDV |
| DNA/RNA chiết tách từ mẫu thật đã biết nồng độ | Phản ánh điều kiện thực tế | Phù hợp trong thẩm định phương pháp nội bộ |
Trong đó:
Nồng độ DNA được đo bằng máy đo nồng độ/ huỳnh quang/ hoặc từ COA (ng)
HsAvo : Hằng số Avogadro: 6.022×1023
ldna : Chiều dài của đoạn mẫu , tính theo cặp bazơ (bp);
ng (nanogam) : Hệ số chuyển đổi sang nanogam :1×109
Wcặpnu : Trọng lượng trung bình của một bazơ hoặc cặp bazơ, tính bằng dalton (Da) = 660 (dsDNA)
✅ Tính toán tổng thể tích cần pha loãng – đảm bảo độ chính xác
Một lỗi phổ biến là không chuẩn bị đủ thể tích, dẫn đến phải “chế thêm” hoặc lấy từ các ống đã pha → sai số cao, không đồng đều.
Gợi ý quy trình pha:
-
Số điểm pha loãng: 5–7 điểm
-
Mỗi điểm chạy triplicate: cần 3 phản ứng x 20 μL = 60 μL
-
Thêm hao hụt kỹ thuật: 10–20 μL mỗi ống
5. Kết luận
Việc xây dựng đường chuẩn đúng cách là nền tảng để có kết quả định lượng chính xác trong real-time PCR, đặc biệt quan trọng trong các ngành kiểm nghiệm như thú y, thực phẩm, môi trường, FEED. Việc mắc lỗi dù nhỏ cũng có thể làm mất dữ liệu, hoặc gây hiểu nhầm nguy hiểm trong chẩn đoán dịch bệnh.
Hãy đầu tư thời gian kiểm soát từng bước nhỏ trong việc pha loãng, pipet, và phân tích đường cong để đạt kết quả ổn định, tin cậy.
Bạn cần tư vấn thiết bị real-time PCR, hóa chất hoặc giải pháp tối ưu cho kiểm nghiệm?
Liên hệ ngay với Cao Gia Biotech để được hỗ trợ giải pháp trọn gói: info@caogiabiotech.com – https://caogiabiotech.com
***Bài viết này là đúc kết từ kinh nghiệm thực tiễn nhiều năm nghiên cứu và thực nghiệm từ đội ngũ nhân sự Công ty TNHH CNSH Cao Gia, cùng với sự tham khảo một số tài liệu – nhằm chia sẻ thêm một số góc nhìn cho các kỹ thuật viên phòng xét nghiệm – những anh/chị làm việc liên quan. TUY NHIÊN, MỌI NỘI DUNG CHỈ NÊN ÁP DỤNG KHI ĐÃ HIỂU RÕ BẢN CHẤT VÀ CẦN TUYỆT ĐỐI THẬN TRỌNG TRONG THAO TÁC THỰC TẾ.
Nếu quý độc giả/ quý khách hàng có ý kiến đóng góp hay bất cứ phản hồi, góp ý – xin hãy gửi thông tin về mail: marketing@caogiabiotech.com
– Với phương châm Tận Tâm – Uy tín – Đồng hành cùng phát triển Cao Gia luôn sẵn sàng và mong muốn lắng nghe mọi phản hồi/ góp ý từ phía quý độc giả/ quý khách hàng dù là nhỏ nhất.
Đội ngũ kỹ thuật CNSH Cao Gia
CÔNG NGHỆ SINH HỌC CAO GIA
Trách nhiệm – Khoa học – Khát vọng
