PHÂN BIỆT DƯƠNG TÍNH THẬT/ GIẢ TRONG XÉT NGHIỆM REAL-TIME PCR FOOD/FEED
*** Nên kết hợp với bài Phân biệt dương tính thật/ giả trong xét nghiệm real-time PCR – ứng dụng trong thú y để có thêm thông tin !!!
*** Một số mẹo và kinh nghiệm thực hành real-time PCR
*1CFU sử dụng trong bài viết này – được hiểu là 1 khuẩn lạc phát triển từ 1 tế bào vi khuẩn ban đầu
I. KHÁI NIỆM CỐT LÕI: DƯƠNG TÍNH THẬT vs. DƯƠNG TÍNH GIẢ
Phân biệt dương tính thật/ giả trong xét nghiệm real-time PCR (qPCR), dương tính giả là kết quả cho thấy có tín hiệu huỳnh quang (Ct dương) dù trong thực tế không có trình tự/ tác nhân mong muốn trong mẫu. Đây là mối nguy quan trọng trong lĩnh vực kiểm nghiệm thực phẩm, đặc biệt khi làm việc với:
-
Thực phẩm chứa GMO (gen 35S, NOS, MON810…)
-
Vi sinh vật gây bệnh: Listeria monocytogenes, Salmonella spp., E.coli O157
-
Chất gây dị ứng: đậu phộng, gluten, casein…
Sự nhầm lẫn giữa dương tính thật và giả có thể dẫn đến:
-
Hủy lô hàng xuất khẩu (false positive)
-
Phát sinh truy xuất sai quy định
-
Gây thiệt hại tài chính và rủi ro pháp lý
II. NGUYÊN NHÂN GÂY DƯƠNG TÍNH GIẢ TRONG THỰC PHẨM
1. Nhiễm chéo DNA đích
-
Từ mẫu chuẩn hoặc lô trước → nhất là trong các trường hợp các mẫu dương tính từ lô xét nghiệm trước đó có nồng độ cao, dễ gây ra sự lưu hành trong phòng lab, nhiễm chéo vào các lô xét nghiệm sau.
-
Từ môi trường thao tác không sạch → các sol khí khi thao tác pipette, lọ đậy hở, quên thay đầu tip, không khí trong phòng hỗn loạn, tủ thao tác không bao đảm vô trùng.
2. Tín hiệu huỳnh quang sai (nhiễu quang học)
-
Do các thành phần kit bị suy giảm chất lượng, hoặc quá trình tách chiết không đảm bảo tinh sạch, hoặc do nền mẫu phức tạp gây ra nhiễu nền, bong bóng trong giếng PCR, phản ứng primer-dimer.
3. Phản ứng chéo với các chuỗi tương tự
-
Các thành như primer/probe không thiết đảm bảo đặc hiệu, dễ tạo cấu trúc kẹp tóc, tự bắt cặp, nhất là trong các phản ứng multiplex.
4. DNA phân mảnh hoặc các chất ức chế trong mẫu
-
Trong mẫu đã qua xử lý nhiệt (đồ hộp, thực phẩm lên men), mảnh DNA tồn tại nhưng không có khả năng gây biểu hiện sinh học, gây kết quả dương tính kỹ thuật nhưng âm tính sinh học..
-
Chất ức chế PCR (Inhibitors): Polyphenol (trà, cà phê), polysaccharide (rau củ), chất béo (thịt, sữa) có thể làm giảm hiệu suất PCR, dẫn đến âm tính giả hoặc kết quả không ổn định (tưởng nhầm là dương tính giả).
III. KINH NGHIỆM THỰC HÀNH PHÂN BIỆT DƯƠNG TÍNH GIẢ
A. Quan sát kỹ hình dạng đường cong tín hiệu real-time PCR:
| Tín hiệu | Diễn giải |
|---|---|
| Đường cong mượt, không gấp khúc, không đứt gãy xuất hiện sau 15–35 chu kỳ | Dương tính thật |
| Đứng thẳng, lệch phải, không cân bằng (bão hòa) | Primer-dimer, tín hiệu giả |
| Tín hiệu bất thường >37 Ct | Có thể do nhiễu, DNA phân mảnh, nền mẫu nhiễu |
| Tín hiệu chỉ có trong 1 giếng lặp lại | Không đáng tin cậy → nghi ngờ giả |
B. So sánh với đối chứng (PC, IC, NTC)
-
NTC có tín hiệu: cần loại bỏ kết quả – nghi nhiễm chéo mix hoặc môi trường
-
PC Ct lệch >2 giữa các lần chạy: kiểm tra mix, enzyme hoặc máy
-
IC mất tín hiệu hoặc tăng Ct đột biến: mẫu có chất ức chế PCR → cần xử lý mẫu lại (tinh sạch lại, pha loãng)
C. Lặp lại (re-test) bắt buộc với mẫu nghi ngờ
-
Pha loãng 1:10 và chạy lại → nếu dương thật: Ct tăng ~3.3, đường tín hiệu tương đương với lần trước
-
Chiết lại mẫu bằng phương pháp tách khác → loại trừ nhiễu kit hoặc hóa chất
-
Test chéo gen đích khác (đặc biệt với GMO): ví dụ nếu dương 35S → test lại NOS, adh (maize) hoặc lectin (soy)
D.GIỚI HẠN PHÁT HIỆN TRONG qPCR THỰC PHẨM – THỬ THÁCH/ KINH NGHIỆM
Trong thực tế do các biện pháp phòng ngừa từ đầu trong các quy tình chế biến thực phẩm (vệ sinh, khử trùng…) mục tiêu PCR trong thực phẩm nghèo hơn, ẩn sâu hơn, và dễ bị ức chế hơn so với các mẫu bệnh phẩm, mẫu sinh học trong thú y/ y tế như : máu, mô, môi trường,….
D.1. Giới hạn phát hiện (LOD – Limit of Detection)
Độ nhạy xét nghiệm PCR thường được xác định bằng giới hạn phát hiện nhỏ nhất có thể xác định được ≥95% số lần thử, ký hiệu là LOD₉₅.
| Đối tượng kiểm tra | LOD phổ biến food/feed | Ghi chú |
|---|---|---|
| Vi sinh vật gây bệnh (Listeria, Salmonella) | 10–100 CFU*/g (sau tiền xử lý) | Thường cần giai đoạn tiền tăng sinh (enrichment 18–24h) |
| GMO (gene 35S, MON810) | 0.1–0.5% (w/w DNA GMO/total) | EU quy định ngưỡng ghi nhãn: ≥0.9% |
| Chất gây dị ứng (đậu phộng, gluten) | 1–10 ppm (mg/kg) | Phụ thuộc vào phương pháp chiết và primer đặc hiệu |
| Vi sinh vật chỉ thị vệ sinh (E.coli tổng, Bacillus cereus) | 100–1000 CFU*/g | Thường không ưu tiên dùng qPCR vì hàm lượng cao, dùng plate count |
D.2. Nền mẫu thực phẩm/ thức ăn chăn nuôi rất đa dạng và là “thách thức thực sự” với PCR/real-time PCR
| Nền mẫu | Chất ức chế PCR điển hình | Biện pháp khắc phục |
|---|---|---|
| Socola, cacao | polyphenol, chất béo | Tăng cường các biện pháp tinh sạch DNA/RNA như cột silica, nhựa resin, hoặc dùng kit tách DNA chuyên biệt |
| Thịt chế biến | hemoglobin, muối, nitrate | Pha loãng mẫu, test IC bắt buộc |
| Gia vị (ớt, tiêu) | Piperine, alkaloid, sắc tố, Capsaicin | Tách lại DNA, thử loại resin bằng kit cột hoặc từ, Thêm chất tăng cường PCR: BSA, Tween 20 hoặc DMSO |
| Sữa, phô mai | protein sữa, chất béo cao | Tiền xử lý bằng SDS/Proteinase K, ly tâm lạnh |
D.3. Độ nhạy còn phụ thuộc vào:
-
Hiệu quả chiết tách DNA/RNA: thường < 50% trong thực phẩm phức tạp, mẫu có bổ sung các loại gia vị, phụ gia.
-
Tình trạng DNA phân mảnh: phổ biến trong sản phẩm qua nhiệt (luộc, hấp), các sản phẩm đã trải qua thanh trùng, tiệt trùng, khử trùng…..
-
Hiệu suất phản ứng enzyme (amplification efficiency): tốt nhất trong khoảng 90–110%
*** TẠI SAO DƯƠNG TÍNH GIẢ DỄ XẢY RA TRONG PCR THỰC PHẨM?
| Lý do | Mô tả |
|---|---|
| Mục tiêu hiếm gặp về số lượng (low target copy) | Vi sinh nguy hiểm bị kiểm soát rất kỹ → <10 CFU/g → tín hiệu yếu |
| Nền mẫu chứa nhiều PCR inhibitors | Gây mất IC, tăng Ct bất thường, dẫn đến phân tích sai |
| Các đoạn DNA đứt gãy | Các vi sinh vật đã chết, không có khả năng gây hại, nhưng DNA vẫn còn tồn tại → gây dương tính kỹ thuật nhưng âm tính sinh học. |
| Tín hiệu yếu dễ trùng với tín hiệu nhiễm | Ct >36 thường nằm vùng “nhiễu” – rất khó phân biệt |
| Độ lặp lại kém trong khi mẫu có Ct cao | Giếng có – giếng không → nghi ngờ chính đáng nhưng cần xác nhận lại |
IV. KHUYẾN CÁO KỸ THUẬT XỬ LÝ MẪU NGHI NGỜ DƯƠNG GIẢ
| Tình huống | Hành động khuyến nghị |
|---|---|
| Dương 1 giếng, âm giếng còn lại | Chạy lại cả hai giếng, thay mới tip, mix |
| Ct >37, tín hiệu không chuẩn | Tăng lượng mẫu đầu vào, test lại/ tiến hành test với gen khác song song |
| Mẫu dương tính và Chứng âm cùng Ct trễ | Loại toàn bộ lô, làm lại với kiểm soát nghiêm ngặt |
| Mẫu dương tính với GMO chỉ 1 gen (35S) | Bổ sung test ít nhất 1 gen khác (NOS/MON810) |
| Tin hiệu đẹp nhưng IC không có (Ct không quá thấp >20) | Mẫu có ức chế → tách chiết lại mẫu |
V. KẾT LUẬN:
-
Luôn yêu cầu tiền xử lý mẫu bằng làm giàu/ tiền tăng sinh (nếu xét vi sinh vật) – ví dụ: Salmonella → phục hồi/ tiền tăng sinh 24h mới chạy real-time PCR
-
Test nội chuẩn (IC) trong tất cả giếng mẫu – để kiểm tra hiệu quả khuếch đại, giúp phân biệt âm giả
-
Tránh kết luận vội vàng Ct >37 là dương tính nếu không có bằng chứng hỗ trợ: tín hiệu bất thường, đối chứng âm có tín hiệu, không lặp lại
-
Nên kiểm tra song song ≥2 gene đích nếu có thể – đặc biệt trong GMO, gene dị ứng → giảm dương giả
-
Ghi chú và xử lý lặp lại các mẫu “vùng xám” (Ct >35) → cần quy trình xác nhận lại mẫu (retest workflow)
VII.TÀI LIỆU THAM KHẢO:
- ISO 22174:2023 – Guidelines for validation of molecular methods in food microbiology
- JRC GMO Testing Database – https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu
- US FDA BAM Chapter 4A/4B – Real-time PCR Detection of Listeria and Salmonella in Foods
- Codex Alimentarius CAC/GL 74-2010 – Guideline on Analytical Methods for Allergen Quantification
- AOAC Official Methods – Pathogen detection in food using PCR
- CaoGiaBiotech.com – Phân biệt dương tính giả trong xét nghiệm Real-time PCR
*** BÀI VIẾT NÀY LÀ ĐÚC KẾT TỪ KINH NGHIỆM THỰC TIỄN NHIỀU NĂM NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM TỪ ĐỘI NGŨ NHÂN SỰ CÔNG TY TNHH CNSH CAO GIA, CÙNG VỚI SỰ THAM KHẢO MỘT SỐ TÀI LIỆU – NHẰM CHIA SẺ THÊM MỘT SỐ GÓC NHÌN CHO CÁC KỸ THUẬT VIÊN PHÒNG XÉT NGHIỆM – NHỮNG ANH/CHỊ LÀM VIỆC LIÊN QUAN – Tuy nhiên, mọi nội dung chỉ nên áp dụng khi đã hiểu rõ bản chất và cần tuyệt đối thận trọng trong thao tác thực tế.
Nếu quý độc giả/ quý khách hàng có ý kiến đóng góp hay bất cứ phản hồi, góp ý – xin hãy gửi thông tin về mail: marketing@caogiabiotech.com
– Với phương châm Tận Tâm – Uy tín – Đồng hành cùng phát triển Cao Gia luôn sẵn sàng và mong muốn lắng nghe mọi phản hồi/ góp ý từ phía quý độc giả/ quý khách hàng dù là nhỏ nhất.
Đội ngũ kỹ thuật CNSH Cao Gia
CÔNG NGHỆ SINH HỌC CAO GIA
Trách nhiệm – Khoa học – Khát vọng
