Đóng

Chuyên Mục Khác

Chuyên Mục Khác

MỘT SỐ KINH NGHIỆM VÀ MẸO THỰC HÀNH REAL-TIME PCR THÚ Y

I. Khâu tiền xử lý và tách chiết – Nền tảng của mọi kết quả

1. Chất lượng mẫu là điều kiện tiên quyết

  • Mẫu nên được bảo quản lạnh ngay sau khi lấy (2–8°C), không để đông-tan nhiều lần.

  • Không lấy mẫu sau khi đã dùng kháng sinh hoặc thuốc sát trùng → dễ âm tính giả.

  • Với mô nội tạng, chọn mô tổn thương rõ, không hoại tử nặng.

  • Lấy mẫu swab: cần nhúng vào VTM ngay và bảo quản lạnh, tránh swab khô.

2. Tách chiết acid nucleic (DNA/RNA):

  • Luôn kiểm tra lại ngày hết hạn và số lô bộ kit, kiểm soát bằng mẫu dương/nghiệm.

  • Làm sạch pipet, thay tip thường xuyên, tránh tiếp xúc chéo giữa các mẫu.

  • Sử dụng máy ly tâm đủ lực (≥10.000 rpm) để tránh acid nucleic bị rửa trôi.

3. Mẹo cá nhân:

  • Sử dụng carrier RNA cho mẫu virus RNA (như PRRS, PED, Avian Influenza) để tăng hiệu suất tách chiết RNA.

  • Nếu dịch bệnh nguy hiểm, nên tách mẫu nguy cơ cao riêng, cuối lượt, hạn chế lây nhiễm chéo trong mẻ xét nghiệm.

II. Thao tác PCR – Chính xác đến từng microlit

1. Pha mix theo master mix chung

  • Giảm sai số thao tác bằng cách pha mix cho cả lô xét nghiệm, sau đó phân bổ đến từng giếng – đảm bảo đồng nhất các thành phần phản ứng.

  • Dùng pipet 2–20 µL cho các bước <5 µL, sử dụng đầu tip có lọc là điều bắt buộc trong real-time pcr/ SHPT.

  • Không trộn ngược chiều thứ tự mẫu với bản đồ plate – dùng mã màu hoặc sơ đồ  hoặc ghi chú rõ ràng.

2. Không lắc vortex ống phản ứng sau khi cho enzyme và primer/probe vào:

  • Thay bằng đập nhẹ hoặc spin ngắn (~3s), vì vortex có thể phá vỡ cấu trúc đứt gãy primer/probe.

3. Cách bố trí plate/strip

  • Sắp xếp mẫu dương – âm – mẫu thực tế xen kẽ, kiểm soát lây chéo, nên tiến hành lặp lại cho mỗi đối chứng.

  • Mẫu lặp nên đặt cách nhau >2 giếng nếu nghi ngờ nhiễm.

III. Phân tích kết quả Real-time PCR – Đọc đúng là sống còn

1. Kiểm tra đường cong tín hiệu (ampli curve)

  • Đường cong phải có dạng sigmoid điển hình, tăng đều từ baseline đến lũy thừa đến bão hòa.

  • Nếu tín hiệu “nhảy vọt” không đều, cần xem lại:

    • Có nhiễm chéo không?

    • Có lỗi pipet/ bụi/ hơi nước/bọt khí trong giếng không?

2. Xem Ct (Cycle threshold)

  • Ct < 30: tải lượng cao, tin cậy.

  • Ct 30–35: tải lượng trung bình, cần so sánh nội chuẩn.

  • Ct >35: có thể là nền (background) – không nên báo dương nếu không có IC tốt – cần thận trọng khi kết luận dương tính.

3. Không chỉ dựa vào Ct

  • Dù Ct thấp nhưng đường biểu diễn real-time không rõ (nhiễu), vẫn có thể là giả dương.

  • Đường biểu đồ dương tính thật: mượt, tròn, không nhấp nhô (xuất hiện tối thiểu 2 pha (với các chu kỳ cuối, và đủ 3 pha với các chu kỳ sớm).

  • Đường biểu đồ âm tính: đường thẳng, không vượt threshold (đường ngưỡng) sau 35 chu kỳ.

So sánh – phân tích các loại đối chứng:

Đối chứng Ý nghĩa Kết quả kỳ vọng Ghi chú kinh nghiệm
NTC (No Template Control) Âm toàn phản ứng Bắt buộc phải âm, Không có tín hiệu vượt ngưỡng Nếu có tín hiệu → nhiễm chéo trong quá trình pha mix
PC (Positive Control) Kiểm chứng phản ứng Bắt buộc phải dương, đường tín hiệu rõ ràng, Ct ổn định (thường <30) Nếu Ct >35 hoặc tín hiệu bất thường → có thể do enzyme cũ, mix lỗi, nhiệt không đều
IC (Internal Control) Xác nhận chiết tách tốt, không ức chế PCR Đường tín hiệu phải dương, Ct ổn định giữa các mẫu IC không hiện tín hiệu/ Ct không đồng đều → có thể do: ức chế PCR, lỗi chiết tách hoặc pipet
Chứng Âm tách chiết (mẫu trắng chiết cùng lô) Kiểm tra nhiễm chéo từ tách chiết Bắt buộc phải âm, Không có tín hiệu vượt ngưỡng Nếu dương → mẫu trong lô xét nghiệm đã xuất hiện nhiễm chéo cần tiến hành lại tách chiết từ đầu
Chứng Dương tách chiết (mẫu chuẩn/ dương tính đã biết trước kết quả (Ct) chiết cùng lô) Kiểm tra hiệu quả chiết Ct dương ổn định, giống PC (giá trị Ct chênh lệch với giá trị đã biết) Nếu Ct lệch lớn so với PC → nghi vấn giảm hiệu suất chiết tách

IV. Bảo trì và kiểm soát chất lượng thiết bị

  • Hiệu chuẩn máy Real-time PCR định kỳ theo tiêu chuẩn ISO/GLP.

  • Không mở nắp máy giữa chương trình → thay đổi nhiệt độ ảnh hưởng đến tín hiệu.

  • Sử dụng template trắng âm (NTC) và mẫu chuẩn dương hàng ngày để kiểm soát.

V. Kinh nghiệm:

  1. Khi kết quả nghi ngờ (Ct >35): luôn khuyến nghị lấy mẫu lại sau 4 – 24h sau đó hoặc chạy song song 2 gen mục tiêu hoặc 2 loại mix khác nhau (có thể kết hợp phản ứng Melting Curver tìm peak đoạn gen mục tiêu).

  2. Nếu có nghi ngờ nhiễm chéo dương, thử lấy mẫu trắng chạy lặp lại – có thể tìm ra giếng nhiễm chéo từ lô xét nghiệm trước.

  3. Ghi chú kết quả kỹ càng, kể cả bất thường nhỏ (ví dụ: curve gãy, mix đục…), để hỗ trợ truy xuất khi cần.

*** BÀI VIẾT NÀY LÀ ĐÚC KẾT TỪ KINH NGHIỆM THỰC TIỄN NHIỀU NĂM NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM TỪ ĐỘI NGŨ NHÂN SỰ CÔNG TY TNHH CNSH CAO GIA NHẰM CHIA SẺ THÊM MỘT SỐ GÓC NHÌN CHO CÁC KỸ THUẬT VIÊN PHÒNG XÉT NGHIỆM – NHỮNG ANH/CHỊ LÀM VIỆC LIÊN QUAN – Tuy nhiên, mọi nội dung chỉ nên áp dụng khi đã hiểu rõ bản chất và cần tuyệt đối thận trọng trong thao tác thực tế.

Nếu quý độc giả/ quý khách hàng có ý kiến đóng góp hay bất cứ phản hồi, góp ý – xin hãy gửi thông tin về mail: marketing@caogiabiotech.com

–  Với phương châm Tận Tâm – Uy tín – Đồng hành cùng phát triển Cao Gia luôn sẵn sàng và mong muốn lắng nghe mọi phản hồi/ góp ý từ phía quý độc giả/ quý khách hàng dù là nhỏ nhất.

 Đội ngũ kỹ thuật CNSH Cao Gia               

CÔNG NGHỆ SINH HỌC CAO GIA           
Trách nhiệm – Khoa học – Khát vọng                 

© 2022 Copyright by Công ty TNHH Công nghệ Sinh học Cao Gia. All rights reserved